ПЛР-аналіз: метод діагностики, що виявляються інфекції

ПЛР-діагностика: на чому заснована, як роблять, біоматеріал та підготовка, для яких хвороб підходить?

ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) – досягнення молекулярної біології, одна з головних методик клінічної лабораторної діагностики кінця 20-го і початку 21-го століть, приносить величезну користь в різних областях медичної науки.

Багато людей плутають її з ІФА (імуноферментний аналіз), що, загалом-то, зрозуміло. Вони в чомусь схожі, оскільки виконують одну задачу – пошук причини патологічних станів, зумовлених проникненням в організм людини інфекційних агентів. Однак між ними є й відмінності. ІФА, наприклад, шукає сліди перебування мікроорганізмів, тобто, антитіла (АТ), а ПЛР знаходить «святая святих» збудника – ДНК або РНК (нуклеїнові кислоти), що дають життя чужим людського тіла мікроскопічних істот.

Методами ПЛР доступні нуклеїнові кислоти «ворога», що знаходяться у всіх біологічних рідинах і тканинах організму, тому даний аналіз не зобов’язує використовувати в якості дослідження тільки венозну кров, можна взяти слину, виділення з статевих шляхів, мокротиння або іншу середу, несе інформацію про захворювання. Вибір матеріалу для дослідження залишається за лікарем, який передбачає ту чи іншу патологію і знає, яка середовище в таких випадках більш інформативна.

В чому суть полімеразної ланцюгової реакції?

ПЛР-дослідження – це досягнення і величезна заслуга молекулярної біології. Це — метод, який, виявивши мікроділянки ДНК або РНК чужорідного генетичного матеріалу (геному), здатний розпізнати індивідуальні характеристики, властиві тільки одному виду мікроорганізмів, не сплутавши його ні з яким іншим. Як же працює метод ПЛР і як йому вдається відновити картину поведінки інфекційної клітини в живому організмі?

процес проведення ПЛР

Отже, фрагмент нуклеїнової кислоти знайдений, але він один і для проведення реакції його явно недостатньо, тому він кодується (копіювання). Однак для подальшого процесу необхідно велика кількість таких мікроділянок, що може забезпечити його розмноження шляхом добудовування нових, ідентичних знайденого фрагменту, ділянок ДНК (реплікація). Розмноження є природним і невід’ємним властивістю нуклеїнової кислоти, яка буде правильно з допомогою ферменту полімерази навіть поза живого організму (у пробірці з пробою), утворюючи безліч клонів, тобто, піде ланцюгова реакція. Клонуватися будуть все нові і нові фрагменти, але тільки ті, в яких зацікавлений дослідник. Ось чому так важливо взяти чистий, без сторонніх домішок аналіз, а тест проводити дуже акуратно.

Враховуючи перераховані здібності полімеразної ланцюгової реакції, можна здогадатися, чому вона так легко відрізняє уреаплазму від мікоплазми, або кожну з них від хламідії.

Таким чином, навіть якщо серед мільйонів клітин людського організму не загубиться сам живий вірус, а лише частка його ДНК, ПЛР, якщо їй ніщо не завадить, мабуть, впорається із завданням і повідомить про перебування «чужинця» позитивним результатом. В цьому суть ПЛР та її основна перевага.

Переваги і недоліки

До лабораторії, що здійснює ПЛР-діагностику, пред’являються найвищі вимоги в плані обладнання, тест-систем і кваліфікації медичного персоналу. Це високотехнологічна лабораторія, яка володіє арсеналом високочутливих і високоспецифічних реагентів, тому особливих недоліків не має. Хіба що видає позитивний результат при відсутності клінічних проявів і тим самим ставить лікарського порадника перед дилемою: чи варто починати лікування чи ні?

Лікар, що спостерігає пацієнта, починає сумніватися в достовірності результатів тестування, оскільки ніяких ознак захворювання не бачить. Але все ж, враховуючи високу чутливість ПЛР-системи, слід пам’ятати, що вона виявляє збудника навіть у доклінічній стадії, а позитивний результат у такому випадку є швидше перевагою, чим недоліком. Виходячи з цього, лікуючий лікар повинен сам прийняти рішення про доцільність терапії, взявши до уваги й інші аргументи «за» і «проти».

Переваги діагностики за допомогою полімеразної ланцюгової реакції очевидні:

Крім цього, щоб уникнути непорозумінь, інший раз виникають при діагностиці, ПЛР захищає себе ще й тим, що її результати можуть зафіксуватися (фотографія, комп’ютер) з метою використання їх в експертних цілях, якщо буде на те потреба.

Нормою у відповідях ПЛР вважають негативний результат, який вказує на відсутність фрагментів чужорідних нуклеїнових кислот, позитивну відповідь буде свідчити про наявність інфекції в організмі, цифрові значення означають стан вірусу і його концентрацію на момент тестування. Однак повну розшифровку аналізу здійснює лікар, який пройшов спеціальне навчання по темі «ПЛР». Намагатися ж інтерпретувати результати самостійно не має ніякого сенсу, оскільки можна, що швидше за все і станеться, неправильно зрозуміти і почати заздалегідь хвилюватися.

Чого «боїться» ПЛР, що вона вміє і як до неї підготуватися?

Як в будь-яких інших дослідженнях, інший раз результати тесту виявляються псевдопозитивними або ложноотрицательними, де ПЛР не є винятком. Подібне може відбуватися у випадках:

1. Порушення технологічного процесу на одному з етапів реакції;
2. Недотримання правил забору матеріалу, його зберігання або транспортування;
3. Присутність сторонніх домішок в матеріалі.

Це говорить про те, що до ПЛР – діагностики інфекцій потрібно підходити уважно, обережно і акуратно, інакше зразки матеріалу можуть поміняти свою структурну будову або зовсім зруйнуватися.

Етапи ПЛР-діагностики. Помилкові результати можуть дати порушення на будь-якому з етапів дослідження

ПЛР-діагностика інфекцій відноситься до категорії «золотих стандартів» серед інших лабораторних методів, тому її можна застосувати для пошуку збудників багатьох захворювань, на перший погляд не мають нічого спільного між собою:

ПЛР-діагностика інфекцій, що передаються статевим шляхом, має особливу значущість, оскільки захворювання, викликані таким чином, часто тривалий час протікають без яких би то не було клінічних проявів, зате при вагітності починають активізуватися і, таким чином, загрожувати здоров’ю і навіть життю дитини. Аналогічно поводяться і TORCH — інфекції. Деякі з них («торч») відносяться одночасно і до ІПСШ, тому останні вимагають більш докладного розгляду. Ознайомитися з найбільш популярними методиками читач зможе в наступних розділах статті.

Як правильно підготуватися, щоб отримати достовірний результат?

Відразу зауважимо, що підготовка до ПЛР досить проста, ніяких особливих зусиль з боку пацієнта не вимагає. Потрібно лише виконати три нескладних завдання:

1. Не мати статевих контактів за 24 години до того, як здати аналіз;
2. Для забору та аналізу крові з вени потрібно прийти на голодний шлунок, пити, до речі, теж не можна;
3. Здати сечу слід нічну (вранці – в стерильну баночку, придбану напередодні в аптеці).

ПЛР може працювати в будь-біологічному середовищі

Метод ПЛР не відрізняється «кровожерністю», тому сприймає будь-яку біологічну середовище, що містить передбачуваний інфекційний агент.Зазвичай вибір – що потрібно взяти для дослідження, залишається за лікарем.

Таким чином, в пошуках збудника, крім аналізу крові (хоча він теж підходить і в більшості випадках береться паралельно іншого матеріалу), можна використовувати:

До вищепереліченого хочеться додати, що матеріалу для тестування у всіх випадках, навіть в зіскрібків і виділеннях, буде достатньо, так як тестування методом ПЛР великих обсягів не вимагає, аналізу вистачає і декількох мікролітрів, які зазвичай беруть в микропробирку типу «еппендорф» і відправляють на дослідження.

Хвороби та застосування ПЛР

ВІЛ і полімеразна ланцюгова реакція

Зазвичай при проходженні анонімного обстеження в разі позитивних результатів імуноблотингу, діагностику ВІЛ-інфекції повторюють заново. Якщо діагноз підтверджується, пацієнтові призначають додаткові дослідження:

1. Визначення за допомогою імунологічних реакцій абсолютних значень кількості лімфоцитів CD4 (імунокомпетентні клітини – Т-хелпери або помічники), які інфекція вражає в першу чергу, після чого вони втрачають свої основні властивості і не можуть відрізнити «своє» і » чуже». Циркулюючу в плазмі крові РНК вірусу вони приймають за нормальні клітини організму і не реагують на них;
2. Виявлення РНК вірусу методом ПЛР та розрахунок концентрації вірусних часток з метою встановлення стадії, тяжкості патологічного процесу і прогнозу з урахуванням цих даних. Зрозуміло, слово «норма» в цьому плані не існує, оскільки реакція завжди позитивна, а розшифровка цифрових значень знаходиться в компетенції лікаря.

ПЛР та гепатити

Методом ПЛР можна виявляти збудників гепатитів, найчастіше тест використовується для діагностики гепатиту З, який погано визначається іншими методами.

Вірус гепатиту С (РНК-містить) за своєю поведінкою в організмі людини нагадує ВІЛ. Вклиниваясь в геном клітин печінки (гепатоцитів), він перебуває там в очікуванні свого часу, який може наступити хоч через 2 роки, хоч через 20 років, тому медики прозвали його «ласкавим вбивцею». Гепатит С призводить до формування злоякісного процесу в печінковій паренхімі, який виявляється на пізніх стадіях. Всі ці події імунна система не помічає, приймаючи вірус за гепатоцити. Правда, антитіла до вірусу в деяких кількостях виробляються, однак вони не забезпечують гідний імунну відповідь. Для діагностики ІФА на гепатит С не дуже інформативний, оскільки вказує на те, що вірус залишив сліди, а пішов сам – невідомо. При ВГС відомі випадки самовиліковування, в той час як антитіла проти вірусу залишаються і продовжують циркулювати довічно (імунологічна пам’ять). ПЛР помітно випереджає утворення антитіл і може виявити вірусну частинку вже через 1-1,5 тижні, в той час як АТ можуть з’явитися в інтервалі від 2 місяців до півроку

ПЛР-діагностика у разі підозри на розгул вірусу гепатиту С в організмі людини є найбільш оптимальним методом дослідження, тому що тільки вона здатна розпізнати присутність «ласкавого ворога» в крові або біоптаті печінки пацієнта.

Однак іноді мають місце випадки, коли АТ позитивні, а результат ПЛР – негативний. Таке іноді відбувається при дуже низькій кількості вірусу або при його «дрімаючому» стані печінки без виходу в кров’яне русло. Щоб все-таки знайти істину, у пацієнта беруть повторний аналіз, а то й не один.

Папіломовірусна інфекція

ВПЛ (вірус папіломи людини), якщо не відбудеться самовилікування, теж може, нічим себе не проявляючи, довго персистувати в організмі господаря, який про це навіть не підозрює, оскільки ПЛР зробити не доводилося, а симптоми хвороби відсутні. Однак наявність папіломовірусною інфекції, нехай і латентною, далеко не байдуже для здоров’я людини, де особливу небезпеку несуть певні типи вірусу, що викликають онкологічні захворювання (типи 16, 18).

Частіше від ВПЛ страждає жіноча половина населення, так як вірус більше любить жіночу статеву сферу, а особливо – шийку матки, де деякі типи вірусів сприяють розвитку диспластичних процесів, а потім і раку шийки матки, якщо не лікувати дисплазію і дати волю вірусу. Так от, полімеразна ланцюгова реакція виявить вірусну ДНК, а потім вкаже «поганий» або «хороший» (онкогенний або неонкогенний) тип оселився в організмі жінки.

Інші ІПСШ та TORCH-інфекції

Очевидно, що полімеразна ланцюгова реакція може знайти будь-яку чужорідну структуру, що складається з нуклеїнових кислот, тому даний тест підходить для виявлення всіх ЗПСШ та TORCH-інфекцій, тим не менш, він далеко не завжди використовується. Навіщо, скажімо, проводити такі дорогі дослідження для виявлення трихомонади або гонокока, якщо є більш доступні і дешеві?

TORCH-інфекції та ІПСШ настільки взаємопов’язані, що часом важко визначити, до якої групи слід віднести той чи інший збудник. У них взагалі буває складно розібратися, так як це досить різноманітні групи мікроорганізмів, які можуть передаватися статевим шляхом завжди чи тільки при певних умовах (імунодефіцит), а можуть являти інтерес лише при вагітності, зважаючи можливого негативного впливу на її перебіг і на плід.

ПЛР – основний метод виявлення прихованих інфекцій

В основі розвитку клінічних проявів лежать різні збудники, знайти які буває під силу лише ПЛР, що і є її основним завданням іноді спільно з ІФА, а іноді в якості єдиного підтверджуючого тесту, особливо, якщо симптоматика захворювання відсутня. Таку непросту ситуацію може створювати полимикробная інфекція, яка, крім явних збудників, включає ще й умовно-патогенні.

У чоловіків, які страждають запальними захворюваннями статевої сфери, наприклад, уретритом, часто виявляють хламідію, уреаплазму і мікоплазму. Ці ж види несуть небезпеку і жіночого організму. Ті, хто знає підступність хламідії і стикався з нею, напевно, пам’ятають, як важко буває знайти і розпізнати, тому аналізу, виробленого методом ПЛР на хламідії, особливо довіряють, адже сховався в клітці дуже маленьких розмірів паразит поводиться обережно, а шкоди завдає завжди нишком.

Уреаплазма найчастіше розглядається в парі з мікоплазмою. І це неспроста. Дані види, як і хламідію, не відносять ні до вірусів, ні до бактерій, вони проживають всередині клітин і відносяться до ІПСШ, хоча їх присутність у здоровому організмі теж далеко не рідкість. Так от, щоб відрізнити здорового носія від хворої людини, потрібні особливі методи, де ПЛР вважається найбільш надійним, оскільки, зважаючи на особливості будови й поведінки цих мікроорганізмів, інші дослідження виявляються неефективними.

Що стосується вірусу герпесу (тип 1, 2) та цитомегаловірусу, який теж відноситься до герпесвирусам (тип 5), то тут теж ситуація неоднозначна. Інфікованість населення земної кулі наближається до 100%, тому в даному випадку дуже важлива ідентифікація вірусу і його доза, що особливо відіграє роль при вагітності, адже дорослій людині, вірус, прижився в його організмі, часто не доставляє ніяких турбот і ознак захворювання не дає.

Тому не слід ігнорувати призначене лікарем подібне обстеження, адже в деяких випадках полімеразна ланцюгова реакція є обов’язковим і необхідним методом лабораторної діагностики, здатним захистити від серйозних ускладнень не тільки жінку, але і маленького, ще не народженого, чоловічка.

На закінчення хочеться відзначити, що такий чудовий метод, як ПЛР, ось вже більше 30 років служить людству. При цьому, завдання тесту не обмежуються пошуком збудників інфекційних захворювань. Полімеразна ланцюгова реакція, породжена на ґрунті молекулярної біології, нерозривно пов’язана з генетикою, вона успішно застосовується в криміналістиці для ідентифікації обличча в судовій медицині для встановлення батьківства, ветеринарії, якщо клініка для тварин має можливості купувати дороге обладнання, а також в інших галузях (промисловість, сільське господарство тощо).

Відео: ПЛР — суть та застосування